مجید کزازی

چکیده: بید غلات یکی از آفات مهم انباری است خسارت این آفت هم از نظر کیفیت وهم از لحاظ کمی دارای اهمیت زیاد است زیرا لاروها ضمن تغذیه فضولات خود را درون دانه ها انباشته کرده و همراه با پوسته های لاروی و تارهای تنیده شده کیفیت دانه را به شدت دگرگون می کند و در نتیجه ارزش اقتصادی و کیفیت دانه پایین خواهد آمد. با توجه به اینکه حشرات بزرگترین گروه بی مهره گان هستند مطالعه ی همزیست در حشرات مختلف برای شناخت بهتر چگونگی تکامل و آشنایی با رویدادهای اکولوژیکی دارای اهمیت است. در این پژوهش، باکتری های همزیست دستگاه گوارش بید غلات شناسایی شد.برای پرورش بید غلات از جو اصلاح شده با درصد پروتئین بالا استفاده شد. ظرف حاوی جو بعد از آلوده سازی در اطاقک رشد در شرایط دمایی 1±24 درجه سلسیوس ورطوبت نسبی 5 ± 65 درصـد نگهـداری شـدند. جهت جدا نمودن باکتری های دستگاه گوارش بید غلات از بین جمعیت پرورش داده شده 10 لارو (سن 4 ) سالم انتخاب شد. دستگاه گوارش لاروها پس از ضد عفونی در اتانول 70 درصد، هیپوکلریت سدیم 5درصد و آب مقطر خارج شد سپس جهت همگن نمودن دستگاه گوارش از یک میلی لیتر بافر فسفات 0.1مولار با 7pH= استفاده شد. محتویات همگن و رقیق شده در محیط کشت نوترینت آگار کشت داده شد سپس باکتری کشت داده شده از محیط کشت جمع آوری شد و در محیط کشت مایع که شامل 10 گرم پپتون ، 5 گرم عصاره مخمر ، 5 گرم کلرید سدیم ، 0.1 گرم کلرید پتاسیم و یک لیتر آب مقطر کشت داده شد. برای انجام واکنش های زنجیره ای پلیمراز از5 میکرو لیتر Master Mix (که شامل آنزیم Taq DNA Polymerase ، dNTPS، Mgcl2 و آنزیمهای پلیمراز می باشد) ، 2 میکرولیتر DNA استخراج شده ، 1.5 میکرولیتر پرایمر RP2 و 1.5 میکرو لیتر پرایمر FD1 و 15 میکرولیتر Distilled Water که حجم کلی این مواد باید به 25 میکرو لیتر برسد. فرآیند PCR با استفاده از پرایمر های عمومی FD1 و RP2 و توالی ژن 16srRNA در دستگاه ترموسایکلرانجام شد. توالی یابی محصول PCR تهیه شده با همکاری شرکت Bioneer کره جنوبی انجام شد و نتایج در سایت NCBI مورد بررسی قرار گرفت. ویژگی های فنوتیپی باکتری های جدا شده با روش های استاندارد باکتری شناسی مشخص شد. بعد از بررسی تمام کلونی های تهیه شده و مقایسه نتایج بدست آمده بیشترین فراوانی از نظر تعداد کلنی مختص به باکتری mundtii Enterococcus بود و باکتری Ent

سیر گیاهی علفی و دائمی است که به خاطر داشتن ترکیبات گوگرددار و آلیسین میکروب کش است. کرم سیر (Dyspessa ulula) یکی از آفات مهم و یکی از عوامل محدود کننده راندمان این محصول در مناطق مختلف ایران از جمله همدان است که غیر از خسارت مستقیم در انبار سبب آلودگی محموله های سیر و از بین رفتن ارزش صادراتی آن می شود. شناسایی باکتری های سازگار با دستگاه گوارش این آفت مهم می تواند راه گشای کنترل آن با استفاده از دست کاری ژنتیکی این باکتری ها باشد چرا که میکروارگانیسم های دستگاه گوارش حشرات می توانند به سلامت میزبان خود کمک کنند و یا با ایجاد اختلال در دستگاه گوارش برای میزبان خود مضر باشند. در این پژوهش، باکتری های سازگار با دستگاه گوارش کرم سیر، جدا و شناسایی شد. پس از پرورش کرم سیر دستگاه گوارش آن جدا و باکتری های آن روی محیط غنی شده آگار غذایی جداسازی شد. الگوی الکتروفورز پروتئین های محلول سلولی باکتری های جدا شده مقایسه و نماینده های آن ها برای بررسی بیشتر گزینش شدند. ویژگی های فنوتیپی نماینده استرین های باکتریایی جدا شده با روش های استاندارد باکتری شناسی تعیین گردید. بخشی از توالی ژن 16srRNA با پرایمرهای همگانی تکثیر و چیدمان نوکلئوتیدهای آن بررسی شد. نتایج نشان داد که باکتری های جداشده که دارای بیشترین فراوانی بودند وابسته به دو گونه Serratia marcescens و Lactobacillus plantarum هستند. این اولین گزارش از وجود این دو باکتری در دستگاه گوارش کرم سیر در دنیا و ایران است. علاوه بر این فراوانی هر یک از باکتری های شناسایی شده در دستگاه گوارش کرم سیر بررسی گردید و مشخص شد باکتری Lactobacillus plantarum نسبت به باکتری Serratia marcescensاز فراوانی بالاتری برخوردار است. محدودیت تعداد گونه های باکتری هایی جداشده از دستگاه گوارش کرم سیر در مقایسه با سایر آفات گیاهی گویای ویژگی ضد باکتریایی این گیاه به خاطر وجود ترکیبات گوناگون ضد باکتریایی است.

سیر یکی از مهم ترین گیاهان دارویی معطر می باشد که دامنه فعالیت ضد میکروبی وسیعی بر علیه انواع میکروارگانیسم ها دارد. دستگاه گوارش حشرات دارای محیط های متمایز حاوی کلنی میکروارگانیسم است. یک گروه از میکروارگانیسم ها در روده، متعلق به باکتری ها می باشد که به طور بالقوه خدمات بسیار مفیدی را به میزبان خود ارایه می دهند. در این پژوهش اثر عصاره آلیسین سیر روی باکتری های همزیست دستگاه گوارش شب پره هندی و پروانه آرد بررسی شد. در ابتدا باکتری های همزیست دستگاه گوارش شب پره هندی و پروانه آرد با استفاده ار ژن 16SrRNA شناسایی شد. باکتری های Bacillus toyonensis و Serratia marcescence از دستگاه گوارش پروانه آرد و باکتری های Bacillus safensis، Bacillus zhangzhouensis و Bacillus wiedmannii از دستگاه گوارش شب-پره هندی جداسازی و شناسایی شدند. فراوانی هر کدام از باکتری ها در دستگاه گوارش میزبان خود، به دست آمد و داده های به دست آمده بر اساس تعداد کلنی در محیط کشت، در قالب طرح کامل تصادفی آنالیز گردید. سپس میزان آلیسین عصاره سیر به وسیله دستگاه کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) و استاندارد داخلی بوتیل پارابن اندازه گیری شد. میزان آلیسین موجود در عصاره سیر، mg/ml 81/7 به دست آمد. در نهایت آزمایش ارزیابی اثر آلیسین سیر روی باکتری های همزیست شب پره هندی و پروانه آرد، بصورت فاکتوریل در قالب طرح بلوک های کامل تصادفی انجام و برای هر تیمار سه تکرار در نظر گرفته شد. در بررسی اثرات متقابل تیمار های باکتری و غلظت، بیشترین هاله عدم رشد مربوط به غلظت mg/ml 816/7 و باکتری Bacillus safensis با میانگین 4.6567 بود که بیشترین اختلاف را با باکتری Bacillus wiedmanni با غلظت mg/ml488/0، Serratia marcescence با غلظت mg/ml488/0، Bacillus toyonensis با غلظت mg/ml244/0، Serratia marcescence با غلظت mg/ml244/0، Bacillus wiedmanni با غلظت mg/ml244/0 و شاهد داشت. بیشترین و کمترین MIC به ترتیب، مربوط به باکتری Bacillus safensis و Serratia marcescence بود.

گسترش و طغیان سن گندم Eurygaster integriceps در ایران را میتوان مثال خوبی برای گسترش و طغیان حشرات در اثر دخالت انسان در محیط طبیعی ذکر کرد. امروزه بیشتر توجهات به مهارکنندههای آنزیمی گیاهان و اهمیت آنها برای ایجاد گیاهان تراریخته معطوف شده است. در این راستا بیان ژنهای آلفا آمیلاز گیاهی نشانههای امیدبخش را برای کنترل آفات میدهد. همچنین بیان ژنهای آلفا آمیلاز در بعضی محصولات، مقاومت محصول را در برابر یک آفت خاص نشان میدهد. اولین مثال در موارد استفاده از یک گیاه تراریخته که یک پروتئین دفاعی را رمز گزاری میکرد به 1987 میلادی برمیگردد. در آن زمان مهارکنندههای تریپسین گیاه باقلا در برگ های توتون حاوی ژن این مهارکننده تجلی یافت؛ بازدارنده های آلفا آمیلازی در میکروارگانیسمها، بیشتر گیاهان و جانوران به فراوانی یافت می شود. پروتئینهای بازدارنده در گیاهان، بیشتر در اندام های ذخیره-ای، مانند دانه ها و غده ها وجود دارند؛ که شامل 1 تا 10 درصد از مجموع کل بازدارندهها را تشکیل می دهند. داشتن ساختارهای مختلف و خواص بیوشیمیایی متفاوت باعث به وجود آمدن بازدارند های مختلف پروتئازی شدهاند. در تحقیق حاضر اثر بازدارندههای استخراجی رقم دنا و لاین EDYT-M90-9، EDYTM90-18 را بروی فعالیت آمیلازی و پروتئازی معده سن گندم مورد بررسی قرار دادیم. درصد مهارکنندگی آنزیم آلفا آمیلاز برای رقم دنا 34.90، برای لاین EDYT-M90-9 40.057 و برای لاین EDYTM90-18 35.40 درصد بود. بیشترین میزان مهارکنندگی فعالیت پروتئولیتیک کل گوارشی در لاین EDYTM90-18 با میزان% 49.48 و به دنبال آنلاین EDYT-M90-9 با میزان% 39.79 و رقم دنا با میزان% 32.65 قرار گرفتند؛ و نتایج حاصل از زیمو گرام آنزیم آلفا آمیلاز نشان داد که فعالیت این آنزیم درگروه تیمار حاوی بازدارنده نسبت به گروه کنترل فعالیت کمتری داشته است؛ و لاین EDYT-M90-9 کمترین فعالیت آنزیم مشاهده گردید. همچنین بامطالعه زایموگرام حاصل از فعالیت پروتئولیتیک کل در گروه کنترل تعداد دو باند فعال مشاهده گردید. شدت و اندازه این باندها در گروه تیمار حاوی بازدارنده کمتر مشاهده گردید.